安全で効果的なワクチンを市場に出すためには、探索から、開発、製造、品質管理全体にわたり、強力で信頼性の高い特性評価ツールが必要になります。ここでは、ワクチンの研究開発に重要な、蛋白質、核酸、ウイルス（不活性化もしくは弱毒化）、ウイルス様粒子、脂質ナノ粒子の分子量と粒子径、核酸含有量、力価、凝集、熱及びコロイド安定性の評価方法について、ご紹介します。
多角度光散乱＆動的光散乱検出器は、ワクチン研究に広く利用されています。これらの装置を使用したワクチン研究の文献リストは、PDF（←こちらをクリック）でご確認頂けます。
・mRNA／DNA
mRNAまたはDNAに基づくワクチンは、脂質ナノ粒子、ウイルス様粒子、または他のナノ粒子ベクターを介して送達されることがしばしばあります。 MALSおよび動的光散乱（MALS、DLS）は、mRNA自体、担体(キャリア)粒子、および完全なワクチンの特性評価に役立ちます。
mRNAの生物物理的特性
以下のアプリケーションノート「SEC-MALS測定によるmRNAの生物物理的特性解析」で説明されているように、mRNAの主要な生物物理学的属性は、SEC-MALSとDLSによって定量化できます。 この分析法は、分子量、凝集体のパーセンテージ、回転半径Rg、および流体力学的半径Rhを決定できます。 MwとRgの関係は一本鎖または二本鎖のRNAを識別しますし、Rg：Rhの比率は分子構造を示します。本手法は、これらの特性がmRNAの調製、製剤、および保存条件によってどのように影響を受けるかをさらに調査するために容易に使用することができます。
詳細は、「SEC-MALSを用いたmRNAの生物物理学的特性解析」(←こちらをクリック）でご確認頂けます。
SEC-MALS-DLS測定を行うと、上図のようにmRNAの正確な分子量及び分子サイズを決定できます。また、球状蛋白質と異なる溶出挙動を示すサイログロブリンのような試料の正確な分子量も決定できます。
・脂質ナノ粒子（Lipid Nano Particle:LNP）デリバリー媒体の特性評価
脂質ナノ粒子（LNP）には、ナノエマルジョン、ミセル、固体脂質ナノ粒子が含まれます。 抗原提示細胞を標的とするために、リンパ節への取り込みに最も重要なパラメーターの1つは粒子径です。 直径が約150 nm未満のLNPのみが取り込まれ、より大きなLNPは注入部位に保持されます。 これは、最もパフォーマンスの高いLNPのサイズの狭いウィンドウを示します。
FFF-MALSは、LNP mRNAキャリアの有効性を正確に評価するために、高分解能粒子径分布を決定し、各サイズ画分での粒子濃度を定量化できます。FFF-MALS-DLSシステムの詳細なアプリケーションは、FFF-MALSによる「脂質ナノ粒子およびリポソームの特性評価」（←こちらをクリック）を参照してください。
・ウイルス（不活性化もしくは弱毒性）
これらの複雑なワクチン製品は、複数の血清型を組み合わせたり、しばしばアジュバント（抗原性補強剤）と調製されます。 非対称フローフィールドフローフラクショネーション（AF4）は、このような複雑なサンプルをサイズ別に高分解能で分離します。 分画に続いて、MALS、DLS、UVおよび蛍光検出器を含む複数のオンライン機器が下流に配置され、生物物理学的特性評価が完了します。
下図に示されているインフルエンザウイルスの亜集団の分析では、サイズと総粒子濃度の両方がFFF-MALSによって詳細に定量化されています。 TEMの結果と比較すると、ウイルス濃度が2％、サイズが5％以内で優れた一致を示しています。 小さな二量体ピークも確認されています。
FFF-MALSを補完するプレートリーダー型光散乱測定器DynaPro®PlateReaderは、処理条件と配合に関して、何百ものサンプルのハイスループットスクリーニングを提供します。 サイジングに加えて、この手法はウイルスサンプルの熱安定性をスクリーニングし、ウイルス粒子濃度を決定することができます。
論文の紹介
以下の論文で、FFF-MALSと、透過型電子顕微鏡（TEM）、原子間力顕微鏡（AFM）、SEC-MALS、リアルタイムPCR(RT-qPCR)、50％組織培養細胞感染率（TCID50）法、のような他の手法と比較したデータを紹介しています。
http://doi.org/10.1016/J.JVIROMET.2007.04.008
・ウイルス様粒子（VLP）
従来の弱毒生ワクチンが行うのと同じ方法で免疫応答を誘発するように設計された組換えウイルス様粒子は、通常、核酸カーゴを備えた蛋白質キャプシドで構成されています。 SEC-MALSおよびFFF-MALSはキャプシドとカーゴの両方を特徴付けますが、DLSはサイズ、凝集、および力価を決定する品質管理ツールとして適しています。
生産プロセスの監視：蛋白質キャプシドとDNAカーゴの測定
VLPの合成には、1）細胞培養からの組換えVLPの分離、2）すべてのDNAを除去したウイルスの五量体カプソメアへの分離、3）目的のDNAの導入、新しく形成されたVLPへのパッケージング、の3つのステップで行われます。
FFF-MALSは、凝集体、組み立てられていないプロトマー、およびカプソメアから完全に形成されたカプシドを分離検出することにより、このプロセスを監視するために使用されます。 この分析はコンフォメーションについて通知し、プロセスの最終ステップでタンパク質とDNAのモル質量を同時に測定して、ペイロード（結合薬剤）を定量化します。
検出器にMALS、UV、RI検出器を使用することにより、VLP総和の分子量と、そのうちの蛋白質（キャプシド）の分子量を決定できます。上図のデータは、VLPに1MDaの核酸が取り込まれていることを示します。
FFF-MALS-DLS文献紹介
FFF-MALS-DLSシステムを用いた薬物、遺伝子デリバリー粒子の研究に関する文献リストは、PDF（←こちらをクリック）でご確認頂けます。
ハイスループットスクリーニング
以下の文献で、プレートリーダー型動的光散乱測定器DynaPro PlateReaderを用いた、カプソメアからなるモジュラーワクチン候補の安定化条件のハイスループットスクリーニング方法を紹介しています。
http://doi.org/10.1016/j.bej.2015.04.004
・多糖体及び糖複合体ワクチン
多糖体および蛋白質複合糖質ワクチンは、アジュバントと高分子量多糖抗原を組み合わせ、通常はいくつかの血清型を含みます。 蛋白質複合糖質では、蛋白質アジュバントは多糖に直接共有結合します。分子量はこのタイプのワクチンの免疫原性の中心であるため、SEC-MALSおよびFFF-MALSは、それらの特性評価および品質管理に不可欠です。
サイズと分子量測定
FFF-MALSは、Mwで数十または数百を超えるMDaに及ぶタンパク質-多糖コンジュゲートワクチンを特徴付ける好ましい手段です。 カラムマトリックスがないため、全範囲を分画している間、せん断による劣化はありません。 MALSはモル質量とサイズを同時に決定します。
より小さな分子の場合、SEC-MALSをより簡単に利用できます。 通常、SEC-MALSは、分子の全体的なモル質量を決定できるだけでなく、各溶出画分のタンパク質の含有量と多糖類の含有量を定量化することもできます。詳細は「SEC-MALSによる多価肺炎球菌多糖ワクチンの特性解析」(←こちらをクリック）をご覧下さい。
・蛋白質抗原
蛋白質ワクチンはサブユニットワクチンの一種で、通常は表面抗原です。 モノクローナル抗体やその他の治療用蛋白質と同様に、DLSとSEC-MALSは、蛋白質抗原製品の特性評価、処方、およびプロセス開発のための非常に貴重なツールになります。
DLSによる封入体からのタンパク質ワクチンの精製のモニタリング
組換え融合タンパク質ワクチンの産業規模の生産では、封入体を尿素に可溶化し、リフォールディングするプロセスがDLSによって監視されます。 この研究では、ジスルフィド結合が封入体からの折りたたみモノマーの形成を防ぐことを実証でき、リフォールディングは還元環境で実行する必要があります。
この調査の詳細については、https://doi.org/10.1002/jps.23746を参照してください。
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